体细胞胚胎发生（SE）是实现木本植物规模化无性繁殖、离体再生与遗传改良的核心技术途径，其发生效率受激素信号与肽信号的精细调控。植物磺肽素-α（PSK-α）是一种内源五肽信号分子，前期研究表明其可促进多种林木体细胞胚胎的发生，但介导这一过程的分子调控通路始终未被阐明，严重限制了PSK-α在林木离体再生体系优化与分子育种中的推广应用。因此，解析PSK-α调控木本植物体胚发生的分子机制显得尤为重要。近年来，钙信号（Ca²⁺/钙调蛋白CaM）作为连接胞外肽信号与胞内生理反应的关键转导通路备受关注，但其在PSK-α介导体胚发生过程中的角色却鲜有报道。
近日，The Plant Journal在线发表了我校题为"Phytosulfokine-α regulates auxin-dependent somatic embryogenesis through calcium signaling in hybrid sweetgum"的研究论文。北京林业大学博士研究生包芬为论文第一作者，张金凤教授、赵健副教授和范英明高级实验师为共同通讯作者。该研究以杂交枫香（北美枫香×枫香）胚性愈伤组织（EC）为材料，在掌握其体细胞胚胎发生规律的基础上，开展了外源PSK-α处理对体胚诱导效率、胞质Ca²⁺转运、LsfCaM家族基因表达及生长素合成通路等系列研究，结果如下。
1、双子叶植物中PSK进化模式的分析
作者先前的研究表明，外源性PSK-α处理可提升体细胞胚的成熟效率和发育进程，证实PSK是杂交枫香SE的关键因素。为深入探究LsfPSK的功能特性，作者基于其与梨属（蔷薇科）、苜蓿（豆科）、拟南芥（十字花科）及番茄（茄科）中PSK 基因的同源性，在杂交枫香基因组中鉴定出五个PSK基因。对这五个物种共34个PSK基因进行分析后，系统发育树显示：除梨属的四个PSK基因外，其余所有PSK基因均属于同一亚家族，该亚家族进一步分为Ia和Ib两个分支；这些PSK基因并未按物种聚类，而是分散分布于这两个分支中。基因结构分析表明，PSK基因具有相似的外显子-内含子排列模式，并包含2至3个外显子。保守基序分析显示，PSK蛋白具有相似的结构域组成，且除SlPSK1外所有蛋白均含有保守的“YIYTQ”核心基序。35S::LsfPSK1-5-GFP的荧光信号与质膜标记物（35S::AtPIP2AmCherry）共定位，并在细胞质中亦被检测到，表明LsfPSK1-5同时定位于质膜和细胞质。为深入探究LsfPSK1-5在不同组织中的表达模式，作者进行了定量实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析。结果揭示了LsfPSK1-5在这些组织中具有独特的表达谱：值得注意的是，LsfPSK2与LsfPSK4的转录丰度均在成熟体细胞胚（心形胚、鱼雷胚、子叶胚）中达到较高水平，表明这两个基因可能在体胚发育过程中发挥关键调控作用。
图1PSK-α的功能分析及其前体基因PSK的表达特征
2、LsfPSK在杂交枫香胚性愈伤组织中的功能特征研究
与对照处理相比，在EC成熟阶段施用外源性PSK-α可显著下调四个LsfPSK家族基因的表达水平。针对每个基因均选取了三个转基因细胞系进行RT-qPCR分析，其总体基因表达水平较野生型（WT）高出2.72至4.54倍。后续对WT及LsfPSK2/4-OE细胞系的EC增殖能力（新鲜重量）和成熟效率的研究表明：与WT细胞系相比，LsfPSK2-OE细胞系的增殖能力显著增强，而LsfPSK4-OE细胞系的增殖能力则明显降低；两者产生的体胚数量均显著少于WT细胞系。综上所述，这些结果共同表明过量的内源性PSK会负向调控杂交枫香中的体胚发生。
图2 LsfPSK2与LsfPSK4在杂交枫香体细胞胚胎发生过程中的功能分析
3、沉默LsfPSKR可抑制杂交枫香胚性愈伤组织的增殖与成熟
通过与拟南芥（A. thaliana）和番茄（S. lycopersicum）的PSKR基因进行同源性比对，作者在杂交枫香的基因组中鉴定出LsfPSKR1和LsfPSKR2。系统发育分析与共线性分析表明，LsfPSKR1/2与SlPSKR2及AtPSKR2的亲缘关系更为密切。对不同组织的表达分析表明，LsfPSKR1和LsfPSKR2的转录水平仅存在轻微差异，各组织间的变异幅度均小于两倍。亚细胞定位实验证实这两种蛋白均定位于质膜。在胚性愈伤组织成熟阶段，作者评估了外源性PSK-α处理对LsfPSKR1和LsfPSKR2表达的影响。结果显示两组细胞中这两种基因的表达水平无显著差异。此外这两个基因的表达水平均降至WT的0.41倍和0.61倍。随后对WT及LsfPSKR-RNAi细胞系中EC增殖能力（鲜重）及成熟效率的研究显示：与WT相比，LsfPSKR-RNAi细胞系的体胚形成数量显著减少；其EC增殖能力虽略有下降，但差异无统计学意义。综上所述，这些结果证实LsfPSKR在介导PSK信号传导及体胚形成功能调控中起关键作用，而抑制LsfPSKR表达会同时抑制EC的增殖与成熟。
图3 LsfPSKR在杂交枫香体细胞胚胎发生过程中的功能分析
4、PSK-α信号通路触发胞质Ca2+内流以激活下游信号传导
利用基于旭月非损伤微测技术（NMT）的旭月活体生理检测仪®检测胞质Ca²⁺转运速率，发现EC成熟阶段细胞摄取Ca²⁺，且PSK-α能显著提升Ca²⁺内流速率，表明PSK-α与质膜上的LsfPSKR结合可引发细胞外Ca²⁺内流。所有LsfCaM蛋白均由149个氨基酸组成且具有亲水性。跨组织表达分析表明，LsfCaM2至LsfCaM6基因在体胚发生阶段特异性高表达；值得注意的是，LsfCaM1、LsfCaM6和LsfCaM5在所有组织中均呈现相对较高的表达水平。与对照组相比，PSK-α处理显著提高了LsfCaM的表达水平：LsfCaM4表达显著下调，而LsfCaM1/2/3/5/6则明显上调。系统发育分析、保守结构域分析、序列共线性分析及基因结构分析均显示LsfCaM1/5/6与SlCaM基因具有高度同源性。亚细胞定位实验进一步证实，35S::LsfCaM1/5/6- GFP与35S::LsfPSKR- GFP类似，均定位于质膜。双分子荧光互补（BiFC）及荧光素酶互补成像（LCI）实验揭示了LsfPSKR1与LsfCaM6之间的物理相互作用。综上所述，这些结果表明在杂交枫香的体细胞胚胎发育过程中，PSK-α与质膜上的 PSKR 结合可触发细胞外Ca2+内流，并同时上调LsfCaM1/2/3/5/6的表达。
图4 LsfCaMs的鉴定与表征
5、LsfCaM1/5/6能够正向调控SE
PCR验证结果显示这三个基因共存在28个转基因事件，并对每个基因的三个独立转基因细胞系进行了RT-qPCR分析。结果表明，LsfCaM1、5和6的表达水平均降至WT的0.24–0.65倍。进一步比较了WT系与LsfCaM1/5/6-RNAi细胞系的增殖能力及成熟效率：与WT系相比，LsfCaM1-RNAi和LsfCaM6-RNAi细胞系的EC增殖能力显著增强；而LsfCaM1/5/6-RNAi细胞系的胚胎细胞形成能力显著降低，其中LsfCaM6-RNAi细胞系的胚胎结构受损最为严重。值得注意的是，外源性PSK -α处理可显著恢复LsfCaM6-RNAi细胞系的胚胎形成能力，但其水平仍显著低于WT组。综上所述，这些结果表明LsfCaM1/5/6受PSK-α/LsfPSKR信号通路调控，并在胚胎结构形成中发挥关键作用，其中LsfCaM6的作用最为显著。
图5沉默LsfCaM1、LsfCaM5和LsfCaM6可促进胚性愈伤增殖，但抑制体细胞胚胎的形成
6、钙调蛋白（CaM）与生长素生物合成蛋白（YUCs）的结合介导了PSK诱导的体胚发生
基于拟南芥和番茄的YUC蛋白氨基酸序列，作者在杂交枫香中鉴定出10个YUC同源基因。对这三个物种共30个YUC基因进行综合分析后，所有基因均在系统发育树中被归类为三个独立分支。鉴于LsfYUC6/7/8/9在体胚发生阶段表现出更高的表达水平，作者采用酵母双杂交（Y2H）实验检测了LsfYUC6-9与LsfCaM1/5/6之间的成对相互作用。结果表明LsfCaM6与LsfYUC8/9之间存在特异性相互作用。随后，在本氏烟叶片中利用双荧光互补（BiFC）技术将LsfCaM6与LsfYUC6/7/8/9进行共表达。实验结果显示：仅当LsfCaM6与LsfYUC8或LsfYUC9共表达时才能检测到荧光信号，而与LsfYUC6或LsfYUC7共表达则无荧光信号。
图6 LsfCaM6与LsfYUC8及LsfYUC9相互作用，从而影响内源性IAA水平
结论
本研究完整阐明杂交枫香中PSK-α调控体细胞胚胎发生的分子通路，外源PSK-α被细胞膜上LsfPSKR受体识别后提升胞内cGMP水平并触发钙离子内流，上调LsfCaM家族基因表达，其中LsfCaM6可分别与LsfPSKR1、生长素合成蛋白LsfYUC8/9互作，促进内源IAA积累进而推动体胚分化，沉默LsfPSKR、LsfCaM1/5/6或抑制YUC介导的生长素合成都会显著削弱胚性愈伤分化能力，外源PSK-α可部分恢复LsfCaM6沉默细胞系的发育缺陷，明确了PSK-α依靠Ca2+/CaM信号介导生长素合成调控木本植物体胚发生的完整分子框架，为枫香及其他林木离体再生体系优化与分子育种提供理论支撑。
作者团队介绍：
张金凤，北京林业大学教授，博士生导师，教学名师，女教授协会名誉会长。长期从事林木遗传育种的教学与科研工作，获北京市高等教育教学成果二等奖。主要研究方向是林木良种繁育，专业特长是树木体细胞胚胎发生与倍性育种。主持国家重点研发计划课题、国家“948”计划项目、国家自然科学基金面上项目和省部级重点课题等 9 项。获国家科技进步二等奖 2 项，国家发明专利 9项，植物新品种保护权 11 项，获国家林业和草原局认定的国际领先水平树木体胚发生规模化繁育技术成果 1 项，已发表学术论文 100 余篇。
团队合影 论文第一作者包芬
作者：张金凤团队
审核：杜庆章